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一、细胞简介
人肝癌细胞分离自人肝癌组织，一般呈短梭形或椭圆形，细胞核较大呈椭圆形，染色质疏松色浅，核仁明显。刚分离的肝癌细胞呈圆形，较透亮。培养约4h左右贴壁，12-24h左右开始伸展出形态，24h后可进行换液，约36-48h进入对数生长期，分离纯化3d后接近融合。
二、常规试剂耗材
1、试剂：75%乙醇，清洗液，双抗（Penicillin-Streptomycin），胎牛血清（FBS）等
2、耗材：超净工作台，倒置显微镜，CO2培养箱，外科手术器械，培养瓶，离心管，培养皿，移液器等
三、实验步骤
1、溶液配制：清洗液，消化酶溶液，完全培养液，包被液（利于细胞贴壁生长）
2、包被：配制好的包被液用0.22um滤膜过滤，加2ml到25cm2培养瓶中，室温静置过夜，然后将液体吸掉，瓶口拧松，放置超净工作台风干。（使用之前需用PBS清洗两遍）
3、分离：
①无菌条件下切取新鲜人肝癌组织，清洗液冲洗2-3遍，放入含有双抗的培养基中，4℃冰盒密封运输至实验室
②超净工作太内用无菌镊子取出肝癌细胞，放入预冷的无菌含双抗清洗液中，洗涤去除组织表面的系膜、血管，用镊子剔除脂肪、坏死组织等，漂洗3-4次；
③无菌培养皿中，用眼科剪子将肝癌组织剪成碎块置于无菌离心管中；
④加入37℃预热的消化酶液，用一次性吸管吹打并晃动离心管使消化酶液和肝癌组织充分混合。离心管放入37℃恒温摇床振荡消化15-40min左右（根据显微镜下观察可适当调整消化时间）。每次振荡消化后大组织块沉淀下，吸取上清终止消化，加入酶液继续消化大组织块，直至大部分组织被消化分解；
⑤加入等量完全培养基，充分吹打，终止消化，用80-200目筛网过滤，滤网残留物可用清洗液清洗2-3次；
⑥收集滤液于离心管中，1500rmp离心约5min，弃上清；
⑦底部沉淀用5ml清洗液或完全培养基重悬，1500rmp离心约5min，操作两次，去除杂质；
⑧加入完全培养基重悬，细胞计数板计数，接种细胞至胶原包被的培养瓶中，显微镜下观察后置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养；
⑨24h后换液去除为贴壁细胞及杂质
4、冻存：
①细胞生长至覆盖培养瓶80%及以上时，弃培养液，用PBS清洗细胞1-2次；
②加入1ml0.25%胰蛋白酶消化液，37℃温育1-3min，倒置显微镜下观察细胞消化情况，后加入完全培养基终止消化，将细胞悬液移至离心管中，1500rmp离心约5min，弃上清；
③沉淀用冻存液重悬，并移至冻存管中。将冻存管置于4℃冰箱约20-30min，然后转移至-20℃冰箱放置约1.5h，然后移入-80℃超低温冰箱过夜，24h后转入液氮中长期储存。
